添加生香酵母改善醬油風味的研究

傳統(tǒng)的醬油釀造以大豆、小麥為原料，經(jīng)過天然曬制而成。產(chǎn)品的醬香及酯香突出，但發(fā)酵周期長，設(shè)備利用率低，還受季節(jié)環(huán)境的影響限制，目前占國內(nèi)醬油的比例很小^[1-2]。我國醬油主要采用低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝，也有部分醬油采用低鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝^[3]。這兩種工藝雖然具有發(fā)酵周期短（15—25d）、原料蛋白利用率高和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，但其發(fā)酵溫度高，不利于酵母菌的生長、繁殖，以致生產(chǎn)的醬油風味香氣不足^[1]。

醬油的風味與多種微生物有關(guān)，其中醬油酵母對其風味的形成有重要影響^[1]。從傳統(tǒng)醬油醪分離出來與醬油質(zhì)量密切有關(guān)的酵母主要是魯氏酵母和球擬酵母，其在醬油釀造過程中賦予了醬油醇香、酯香等風味物質(zhì)^[1，4-5]。為了提高醬油的風味，有的醬油廠在發(fā)酵后期添加醬油酵母，取得了良好效果^[6-9]。本研究在陳強^[9]探索的低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生香發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，在低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中添加2株耐鹽醬油酵母進行發(fā)酵，通過比較分析醬油生香發(fā)酵前后主要理化指標和揮發(fā)性風味成分的變化差異，為應(yīng)用醬油酵母生香發(fā)酵技術(shù)，以改善低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的風味提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

生醬油—低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油，酵母JM01和JM06：李錦記（食品）有限公司；

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、葡萄糖、重鉻酸鉀、乙醇（分析純）：中國醫(yī)藥（集團）上海化學(xué)試劑公司。

1.2儀器與設(shè)備

UV1100紫外可見光分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；PAL—a Brix計：日本ATAGO公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；794全自動滴定儀：瑞士萬通（中國）有限公司；TRACE GC-MS-2000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Finnigan公司；HP-INNOWAX毛細管柱：上海笛柏實驗設(shè)備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油酵母生香發(fā)酵工藝流程

低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油酵母生香發(fā)酵工藝參考陳強^[9]的研究，并進行優(yōu)化。

1.3.2生醬油調(diào)配標準

調(diào)配低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的NAC1含量為12%-14%，氨基酸態(tài)氮含量為0.8-0.9g/100mL，總酸含量為2g/100mL左右，可溶性固形物含量為28%-30%，PH值為4.5-5.0，還原糖含量為1.8-2.0g/100mL。

1.3.3添加酵母靜置生香發(fā)酵

調(diào)配好的低鹽稀態(tài)醬油接種醬油酵母，JM06接種量為4%（V/V）JM06與JM01的接種比例為1：1，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為7d。

1.3.4常規(guī)指標測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogenAN）、總酸均按國標GB 18186—2000《釀造醬油》中規(guī)定測定；還原糖按國標GB/T5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中方法測定；固形物采用Brix比重計測定；總酯含量測定：連續(xù)電位滴定法；酒精含量測定：重鉻酸鉀比色法。

1.3.5醬油揮發(fā)性成分測定

固相微萃取：取樣品30mL密封于100mL頂空樣品瓶，置于40℃水浴中電磁攪拌，固相微萃取纖維頂空萃取40min250℃解吸3min后進樣。

氣相色譜分析條件：HP-INNOWAX毛細管柱（30mm×0.25mm）;載氣He，流速1.0mL/min;程序升溫，起始溫度45℃保持5min，升溫速率5℃/min溫度至200℃，保持15min升溫速度10℃/min*終溫度220℃，保持5min；汽化室溫度220℃，進樣量0.8uL。

質(zhì)譜分析條件：電子電離（electron ionizationEI）源，電子能量70eV，發(fā)射電流200uA，電子倍增器電壓350V，離子源溫度200℃，質(zhì)量掃描范圍35-335amu。

數(shù)據(jù)處理：試驗數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件完成，在美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technologyNIST）譜庫（107 000個化合物的數(shù)據(jù)）和Wiley譜庫（320 000個化合物的數(shù)據(jù)，Version6.0）對未知化合物進行檢索并計算匹配度，只有當正反匹配度均大于800（*大值為1000）時才能確證該物質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1低鹽穩(wěn)態(tài)醬油生香發(fā)酵前后主要理化指標比較

根據(jù)陳強^[9]的研究，采用酵母生香發(fā)酵*優(yōu)工藝對低鹽穩(wěn)態(tài)發(fā)酵生醬油進行生香發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后取樣測定其總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、總酯含量、酒精含量、可溶性固形物含量和還原糖含量，與生香發(fā)酵前的原低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油進行對比。

低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生香發(fā)酵后總酸、總酯、酒精含量明顯提高，可溶性固形物、還原糖含量基本保持不變，氨基酸態(tài)氮含量有略微降低。

感官評價方面，生香發(fā)酵后的醬油酯香、醇香濃郁，香氣柔和，風味得到了較大的改善。結(jié)果表明，醬油酵母在低鹽稀態(tài)醬油得到 良好的繁殖代謝，產(chǎn)生的醇類、酯類和有機酸類等物質(zhì)增加了醬油風味，并在一定程度上降低了原醬油的不良氣味。增香后風味評價結(jié)果與李琴等^[10]的研究結(jié)果一致，即酵母菌的添加明顯改善醬油風味。

2.2低鹽 稀態(tài)醬油生香發(fā)酵前后揮發(fā)性風味成分比較

采用固相微萃取技術(shù)對醬油揮發(fā)性成分進行提取，并利用氣-質(zhì)聯(lián)用法進行測定，低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生香發(fā)酵前后的主要揮發(fā)性風味成分的質(zhì)譜。

生香發(fā)酵后的醬油與原低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油相比，其揮發(fā)性成分出現(xiàn)了顯著的差異，物質(zhì)的種類的含量差異（峰面積歸一法）。

原低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生香發(fā)酵后的醇類、酯類、醛類、酸類、酚類和其他化合物等6類主要揮發(fā)性成分在種類和含量上都產(chǎn)生明顯的變化，特別是醇類、酯類這兩類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中的比例明顯提高。

2.2.1醇類化合物

原低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油檢測出7種主要醇類物質(zhì)，醬油生香發(fā)酵后檢測到8種，新增的醇類物質(zhì)為苯甲醇和4-異丙烯基-5-甲基-4-乙烯基-1-醇，減少的醇類物質(zhì)為異辛醇。

原醬油添加生香酵母發(fā)酵后，醬油中的醇類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中的比例由43.76%提高至64.95%，總含量明顯提高。其中，苯乙醇由生香發(fā)酵前的0.55%增加至0.75%。其均是傳統(tǒng)釀造醬油的特征香氣成分，苯乙醇是酵母菌的代謝產(chǎn)物，來源于酒精發(fā)酵過程中苯丙氨酸的降解，具有du特的紫羅蘭香、丁香、茴香味、蜂蜜味及青甜玫瑰的氣息，而3-甲硫基-1-丙醇在濃度較低時即有強烈的肉湯香味^[11-12]。

2.2.2酯類化合物

原低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中檢測出4種酯類物質(zhì)，醬油生香發(fā)酵后檢測出6種，新增加的物質(zhì)為乙酸異戊酯和醋酸苯乙酯。

原醬油生香發(fā)酵后，酯類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中的比例由0.99%增至12.08%，在種類和百分含量上均有了顯著的增加。其中乙酸異戊酯和醋酸苯乙酯的升幅*大，分別由生香發(fā)酵前的0%和0.31%上升至6.19%和5.52%。乙酸異戊酯具有較強的新鮮果香、稍甜，有類似熟香蕉、生梨和蘋果的香味，醋酸苯乙酯具有桃子香氣，這兩種物質(zhì)百分含量的大幅上升對醬油風味的改善起到了重要的作用。酯類物質(zhì)提高的主要原因是酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯化酶對有機酸類與醇類進行酯化作用，這也是揮發(fā)性酸類物質(zhì)含量下降的主要原因^[13-15]。

2.2.3醛類化合物

醬油生香發(fā)酵前后均檢測出8種醛類物質(zhì)，其中相同的成分有7種，分別為壬醛、糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、a-亞乙基-苯乙醛和茴香醛，醬油生香發(fā)酵后新增了肉桂醛，減少了辛醛。醛類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中所占的比例明顯降低，由10.08%下降為4%。醛類物質(zhì)一般不是醬油的特征風味成分，但其能夠與醬油酵母代謝產(chǎn)生的醇類或硫化物反應(yīng)，提高醬油風味^[1]。

2.2.4酸類化合物

原低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中檢測出5種揮發(fā)性酸類物質(zhì)，醬油生香發(fā)酵后檢測到7種，其中相同的酸類物質(zhì)有醋酸、丁酸、戊酸和4-甲基戊酸，新增加的酸類物質(zhì)為反-2-乙烯基環(huán)戊烷羧酸、辛酸和癸酸，減少的酸類物質(zhì)有異丁酸。酸類物質(zhì)在揮發(fā)性成分中所占的比例也明顯降低，由14.45%下降為5.4%，特別是醋酸由10.65%下降為3.94%，表明低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中的酸類物質(zhì)與酵母代謝產(chǎn)物醇類物質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)。另外，常規(guī)理化指標顯示醬油生香發(fā)酵后總酸由1.77g/100mL增至1.94g/100mL，表明了酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了非揮發(fā)性有機酸類物質(zhì)，其主要來源酵母的三羧循環(huán)^[1]，而揮發(fā)性酸類物質(zhì)由于酯化而降低。因此，酸類物質(zhì)的變化促進了醬油風味的柔和。

2.2.5酚類各其他類化合物

醬油生香發(fā)酵前后均檢測出4種酚類物質(zhì)，其中愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基苯酚均是天然發(fā)酵醬油里特有的香氣物質(zhì)，由于生香發(fā)酵時間短，此類風味物質(zhì)變化不大。

其他類化合物包括吡嗪等含氮化合物、呋喃等含氧雜環(huán)化合物、噻唑等含硫化合物以及烴類化合物等，雖然這些物質(zhì)的種類百分含量在醬油生香發(fā)酵后有所下降，但是這些化合物具有非常低的風味閾值，仍然對醬油的整體風味貢獻很大。

綜合表明，低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油添加生香醬油酵母發(fā)酵后，醇類和酯類這兩類物質(zhì)在揮發(fā)性風味成分中的比例顯著提高，特別是異戊醇、3-甲硫基-1-丙醇、苯乙醇、乙酸異戊酯和醋酸苯乙酯等含量比例的提高大大改善了醬油的香氣；在生香酵母的作用下，醛類、酸類、醇類和其他類化合物形成醬油新的香氣成分，既減少一些不良風味，又促進醬油風味更加柔和。

3結(jié)論

低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生香發(fā)酵后總酸、總酯、酒精含量明顯提高，分別由1.77g.100mL、7.84g/100mL和0.09%增至1.94g/100mL、9.85g/100mL和2.12%；可溶性固形物、還原糖含量基本保持不變，氨基酸態(tài)氮含量略微降低。

通過氣相色譜質(zhì)譜用（gas chromatograph-massapectrometer，GC-MS）對低鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生香發(fā)酵前后的揮發(fā)性風味成分進行分析，醇類和酯類物質(zhì)在揮發(fā)性風味成分中的比例由原來的43.76%和0.99%分別提高至64.95%和12.08%；醛類和酸類物質(zhì)由10.08%和14.45%分別下降為4%和5.4%。